CRISPR-screen出自CRISPR实际掌握者张锋，最早的文献应该在2014年的GeCKO，距今已有11岁，CRISPR降低了基因编辑的成本和难度，因此为全基因组规模的大规模筛选提供了条件，并且一路高歌猛进，人人追捧，借此冲刺顶刊者数不胜数~~

本文简要介绍CRISPR-screen的设计思路和基本步骤，对于一些讨论较多的点提供我调查的结果，具体实验步骤（太多辣）可以参考本文末的引用文献

放上一张大家都爱用的总览[^1]：

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1.CRISPR设计

CRISPR最初也就是敲除，但随着后续CRISPR工具箱的开发，CRISPR筛选的设计也能有对应的选择：

  • CRISPR_KO：使用原CRISPR，直接敲除基因
  • CRISPRi：dCas9+抑制子结构域，敲低基因
  • CRISPRa：dCas9+激活结构域，激活对应基因

2.文库构建

sgRNA 寡核苷酸库（oligo pool）获取：
1. sgRNA设计工具设计，找公司合成（eg. https://www.genscript.com/）
2.使用现有筛选文库，直接购买

文库扩增（如需要）+质粒构建
注意使用高保真的试剂盒和高转化效率的菌/细胞，参考[^2]Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library这篇

3.转染：DNA-based or lentiviral

准备目的细胞：稳定表达CRISPR蛋白的细胞系
将筛选文库转染到目的细胞，有两种选择：病毒载体或电转等直接瞬转[^3]

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  • 此处要注意材料的数量关系，以病毒转染为例：
    • $1gene \sim 4sgRNAs$（至少）
    • $1sgRNA >500Infected\ Cells=500TiterV_{virus}$
    • $MOI(\frac{Infected\ Cells}{Totol\ Cells}=\frac{Titer*V_{virus}}{Totol\ Cells}) \approx 0.3$
      • 0.3为张锋nature protocol[^1]中提到的，但是也有研究会选择0.1甚至更低，毕竟后面可以药杀筛出来，所以低一些除了累也没有坏处
    • 大概四次独立实验（？）

目的细胞推荐养在六孔板，已知六孔板每孔约$2.5*10^6$ 个细胞，全基因组筛选基因按2w算：
8w sgRNA
4000w infected cell
1.2亿总细胞数
~10个六孔板（一次生物学重复，转染时细胞推荐70%覆盖）
所以工作量并不小，建议做好心理准备QWQ

4.筛选：阳性筛选和阴性筛选（positive&negative）

  • 阳性
    • 施加阻力条件，只有目的细胞能存活
    • 收集目的细胞进行测序分析即可，与背景无关
  • 阴性
    • 选择的阻力条件会干掉目的细胞
    • 使用对照作为背景，两组都要测
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5.测序和结果分析

测序结果应该和普通RNA-seq结果差不多，因此也能用传统的edgeR、DESeq分析

此外还有专门的如MAGeCK[^4]，除了像上两者计算p值，MAGeCK还会根据p值排序sgRNA，根据排序结果使用RRA算法进一步遴选正筛/负筛基因

此外addgene上还提到一个CRISPR-screen结果的数据库，不想做但有兴趣的可以多加探索[^5]

参考文献：
[^1]: J. Joung et al., “Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening,” Nat Protoc, vol. 12, no. 4, pp. 828–863, Apr. 2017, doi: 10.1038/nprot.2017.016.
[^2]: H. Koike-Yusa, Y. Li, E.-P. Tan, M. D. C. Velasco-Herrera, and K. Yusa, “Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library,” Nat Biotechnol, vol. 32, no. 3, pp. 267–273, Mar. 2014, doi: 10.1038/nbt.2800.
[^3]: “Addgene：池化文库使用指南 — Addgene: Guide to Using Pooled Libraries.” Accessed: Apr. 13, 2025. [Online]. Available: https://www.addgene.org/guides/pooled-libraries/?hsCtaTracking=0ff17516-c8a6-427a-99f8-0f2461180bd3%7C59ae4b95-52da-4c5b-8763-c75a9f64c031
[^4]: W. Li et al., “MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens,” Genome Biol, vol. 15, no. 12, p. 554, Dec. 2014, doi: 10.1186/s13059-014-0554-4.
[^5]: “BioGRID CRISPR Screen Database | BioGRID ORCS.” Accessed: Apr. 13, 2025. [Online]. Available: https://orcs.thebiogrid.org/